Protein microarray กับการประยุกต์ใช้ทางการแพทย์

       ภาพที่ 1. รูปแบบและหลักการทำงานของ protein microarray.

บทนำ
เทคโนโลยีการตรวจวิเคราะห์ยีนและการแสดงออกของยีนในระดับจีโนม (genomics) ด้วยเทคนิค DNA microarray นับเป็นนวัตกรรมที่นำมาใช้ประโยชน์อย่างแพร่หลาย ในช่วง 20 กว่าปีที่ผ่านมา โดยเฉพาะการศึกษาการทำงานของยีนที่ก่อให้เกิดโรค เช่นการตรวจสอบการแสดงออกของยีนระหว่างเนื้อเยื่อปกติและเนื้อเยื่อมะเร็ง การนำเทคโนโลยีนอันทันสมัยนี้มา ใช้ประโยชน์ทำให้แพทย์สามารถตรวจคัดกรอง และตรวจวินิจฉัยโรคเพื่อใช้เป็นข้อมูลสำหรับการตัดสินใจรักษาโรคต่อไป.

ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีที่เกี่ยวข้องกับการตรวจวินิจฉัยโรคทางการแพทย์ในปัจจุบัน นับว่ามีความรุดหน้าเป็นอย่างมาก โดยเมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการนำเทคนิคการตรวจสอบและคัดกรองโรคด้วยวิธี protein microarray ซึ่งเป็นการตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนหลายชนิดได้ในคราวเดียวภายใน ระยะเวลาอันสั้น โดยมีหลักการทำงานที่คล้ายคลึงกับการตรวจสอบการแสดงออกของยีนด้วยวิธี DNA microarray.

การศึกษาการแสดงออกและการทำงานของโปรตีนหลายๆ ชนิดภายในคราวเดียวกันนั้นนับว่ามีประโยชน์อย่างมาก โดยเฉพาะทางการแพทย์และการวิจัยที่เกี่ยวข้องทางด้าน proteomics เช่นการศึกษาการทำงานของโปรตีนในกระบวนการนำส่งสัญญาณภายในเซลล์ (signal transduction pathway) ซึ่งความเข้าใจถึงการนำส่งสัญญาณภายในเซลล์ที่อาศัยการทำงานของโปรตีนหลายชนิดร่วมกันทำให้สามารถออกแบบยา เพื่อรักษาโรคได้อย่างจำเพาะเจาะจงมากยิ่งขึ้น นอกจากนี้ protein microarray ยังมีประโยชน์ในการวินิจฉัยโรคได้อย่างแม่นยำ และรวดเร็วอีกด้วย.

หลักการของ protein microarray^1-3
เทคโนโลยี protein microarray ได้ถูกพัฒนาขึ้นจากการสังเคราะห์ส่วนของโปรตีนจำนวนหนึ่ง โดยส่วนใหญ่เป็นโปรตีนที่ถูกดัดแปลงแล้วทำให้มีความบริสุทธิ์ (purified recombinant protein) หรือเป็นโปรตีนจากส่วนของแอนติบอดี (antibody) ซึ่งโปรตีนเหล่านี้ถูกนำมาใช้เป็นโปรตีนอ้างอิงสำหรับตรวจสอบโปรตีนตัวอย่าง. โมเลกุลของโปรตีนเหล่านี้จะถูกตรึงลงบนแผ่นค้ำจุน (solid support) ในตำแหน่งที่แน่นอน เช่น แผ่นสไลด์แก้ว แผ่นไนลอน หรือแผ่นซิลิโคน เนื่องจากขนาดของแผ่นค้ำจุนที่ใช้ มีขนาดค่อนข้างเล็ก (ประมาณ 1.6 x 1.6 ตารางเซนติเมตร) จึงมีชื่อเรียกโดยทั่วไปว่า protein microarray หรือ protein chip ซึ่งแผ่นค้ำจุนนี้จะสามารถบรรจุโมเลกุลของโปรตีนที่มีอยู่นับแสนโมเลกุล ได้บนพื้นที่ขนาดเล็ก โดยหนึ่งแผ่นของ protein chip จะมีจำนวนจุดหนึ่งพันจุด แต่ละจุดมีขนาดเล็กกว่า 200 ไมครอน ซึ่งบรรจุไปด้วยข้อมูลของโปรตีนโมเลกุลนับล้าน.

ภายหลังจากที่โปรตีนถูกตรึงบนแผ่นค้ำจุน ขั้นตอนต่อมาคือการเคลือบผิวของ protein chip ด้วย blocking agent เพื่อป้องกันการจับกันของโปรตีนชนิดอื่นแบบไม่จำเพาะเจาะจง (non specific binding) ซึ่งอาจเกิดขึ้นในขั้นตอนการตรวจสอบ จากนั้นจึงนำตัวอย่างโปรตีนที่ต้องการตรวจสอบมาทำการเคลือบบนผิวของ protein chip หากโปรตีนตัวอย่างทดสอบสามารถจับกับโปรตีนอ้างอิงที่อยู่บนผิวของ protein chip อย่างจำเพาะเจาะจงจะเกิดสัญญาณภายหลังจากการอ่านด้วยเครื่องตรวจสอบสัญญาณ (scanner).

รูปแบบของ protein microarray
Protein microarray สามารถแบ่งออกได้เป็น 3 รูปแบบ ตามชนิดของโปรตีนอ้างอิงที่ถูกตรึงบนแผ่นค้ำจุนของ protein chip ดังแสดงในภาพที่ 1

1. Protein microarrays (PMAs) จัดเป็นรูปแบบแรกของ protein chip ซึ่งถูกพัฒนาขึ้นเมื่อปีพ.ศ. 25424 โดยโปรตีนอ้างอิงบนแผ่นค้ำจุนของ protein chip ที่ใช้สำหรับ PMAs เป็นโปรตีนที่ถูกดัดแปลงแล้วทำให้มีความบริสุทธิ์ (purified recombinant protein) เพื่อใช้ตรวจสอบสารแอนติบอดี ที่มีความจำเพาะเจาะจงซึ่งใช้เป็นตัวบ่งชี้ (biomarkers) สำหรับตรวจวินิจฉัยโรคในห้องปฏิบัติการ เช่นโรคภูมิต้านทานเนื้อเยื่อของตนเอง (autoimmune diseases) โรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (Severe Acute Respiratory Syndrome; SARS) เป็นต้น.^{5, 6}

2. Antibody microarrays (AMAs) เป็น protein chip ที่มีการนำมาใช้ประโยชน์มากที่สุดในงานตรวจวิเคราะห์และการตรวจวินิจฉัยโรคต่างๆ โดยนำส่วนของแอนติบอดีที่จำเพาะเจาะจงมาใช้ เพื่อตรวจสอบโปรตีนที่เราสนใจ. หลักการทำงานของ AMAs นั้นมีความคล้ายคลึงกับ sandwich immunoassay แต่อาศัยการตรวจสอบที่แตกต่างกัน กล่าวคือ AMAs ต้องการแอนติบอดีที่จำเพาะเจาะจงสองชนิดเพื่อจับกับตำแหน่งที่แตกต่างกันทั้งสองบริเวณของแอนติบอดีที่ถูกตรึงบนแผ่น protein chip ดังนั้นการตรวจสอบด้วยวิธีนี้จึงมีความจำเพาะเจาะจงสูง อย่างไรก็ตาม วิธีการนี้ยังมีข้อจำกัดในการผลิตแอนติบอดีให้มีความจำเพาะเจาะจงสูงเพื่อใช้ในการตรวจสอบ.^{7, 8}

3. Reverse protein microarrays (RPMs) ประกอบด้วยโปรตีนที่ได้จากการสกัดโดย ตรงจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อ ซึ่งอาจได้มาเพียงบางส่วนหรือทั้งหมด (fractionated or whole protein extracts) โดยโปรตีนอ้างอิงเหล่านี้จะถูกตรึงบนแผ่น protein chip ทำให้สามารถตรวจสอบการทำงานของโปรตีนในขั้นตอนหลังผ่านกระบวนการแปลรหัส (post-translationally modified proteins) ได้โดย ตรงและแม่นยำมากยิ่งขึ้น. RPMs ได้นำมาประยุกต์ใช้ในงานหลายประเภท เช่น การตรวจหามะเร็งชนิดต่างๆ จากตัวอย่างของผู้ป่วย โดยใช้แอนติบอดีที่มีความจำเพาะเจาะจงต่อโปรตีนที่ต้องการตรวจสอบ หรือการตรวจสอบชนิดของโปรตีนที่ใช้ในกระบวนการนำส่งสัญญาณของเซลล์ (cell signal transduction).^9-12 จุดเด่นที่สำคัญของ RPMs สำหรับการตรวจวิเคราะห์โปรตีนคือความไวในการตรวจวิเคราะห์ที่ค่อนสูงกว่าวิธีการตรวจวิเคราะห์โปรตีนโดยทั่วไป เช่น ELISA หรือ Western blot analysis ดังนั้น ปริมาณตัวอย่างที่ใช้สำหรับตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธี RPMs จึงมีจำนวนน้อย.^9,13



การประยุกต์ใช้ protein microarray ในทางการแพทย์
1. การตรวจวินิจฉัยโรค (diagnostics) การตรวจวินิจฉัยโรคจัดว่าเป็นขั้นตอนที่มีความสำคัญอันดับแรก ซึ่งจำเป็นต้องอาศัยกระบวนการและขั้นตอนที่มีความแม่นยำและรวดเร็วในการตรวจวิเคราะห์ ดังนั้น protein microarray จึงได้เข้ามามีบทบาทสำคัญสำหรับการตรวจวินิจฉัยโรค โดยสามารถตรวจวิเคราะห์ตัวอย่างได้เป็นจำนวนมากภายในระยะเวลาอันสั้นและสามารถตรวจสอบซ้ำได้หลายครั้ง เนื่องจากความต้องการปริมาณตัวอย่างจำนวนน้อย. ปัจจุบันบริษัทหลายแห่งในประเทศสหรัฐอเมริกา อังกฤษ และเยอรมันนี (เช่น Invitrogen, Zyomyx, Zeptosens, Molecular Staging, Luminex) ได้ผลิต protein chip ออกจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ เพื่อใช้ตรวจสอบสารแอนติบอดีและตรวจสอบสารแอนติเจนที่ถูกสร้างขึ้นจาก serum antibody สำหรับโรคติดเชื้อ (infectious diseases) โรคภูมิแพ้ (allergy) และโรคภูมิต้านทานเนื้อเยื่อของตนเอง (autoimmune diseases). นอกจากนี้ protein microarray ยังมีบทบาทในการตรวจวินิจฉัย tumor marker หลายชนิดที่ได้จากตัวอย่างของผู้ป่วยโรคมะเร็งชนิดต่างๆ ซึ่งจัดว่าเป็นแนวทางใหม่สำหรับการตรวจวินิจฉัยโรคมะเร็งได้อย่างรวดเร็ว.^14-18

2. การศึกษาการแสดงออกของโปรตีนและงานวิจัยด้าน proteomics การนำ protein chip มาใช้ประโยชน์ในการศึกษาการแสดงออกและการทำงานของโปรตีนในภาวะต่างๆ หรือภาวะที่เกิดโรค จัดว่าความสำคัญในการศึกษาทางด้าน proteomics ซึ่งเราสามารถนำ protein chip มาศึกษาเปรียบเทียบว่ามีโปรตีนชนิดใดบ้างที่มีการแสดงออกมากหรือน้อยในผู้ป่วยเมื่อเปรียบเทียบกับคนปกติ แล้ว จึงนำข้อมูลเหล่านั้นมาใช้ในการวินิจฉัยโรค พยากรณ์การเกิดโรค และประเมินความเสี่ยงในการเกิดโรค.^4,12,15 วิธีการศึกษาการแสดงออกของโปรตีนระหว่างผู้ป่วยและคนปกติที่นิยมอย่างแพร่หลายในปัจจุบัน คือ antibody microarray ดังแสดงในภาพที่ 2 โดยโปรตีน ตัวอย่างที่สกัดได้จากผู้ป่วยและคนปกติจะถูกติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (fluorescent) ที่แตกต่างกัน เช่น Cy3 และ Cy5 เป็นต้น จากนั้นจึงนำโปรตีนที่ติดฉลากเหล่านี้มาจับกับแอนติบอดีที่อยู่บนผิวค้ำจุนของ antibody microarray แล้วทำการอ่านด้วยเครื่อง ตรวจความเข้มของสีในแต่ละจุดบนแผ่น antibody microarray เพื่อเปรียบเทียบการแสดงออกของโปรตีนเหล่านั้น ซึ่งสามารถวิเคราะห์โปรตีนต่างๆ ได้เป็นจำนวนมากในระยะเวลาอันสั้น.

     
     ภาพที่ 2. การนำ antibody microarray มาใช้ประโยชน์ในการศึกษาการแสดงออกของโปรตีน
                     ระหว่างโปรตีนที่ได้จากคนปกติและผู้ป่วย.

3. การพยากรณ์และศึกษาผลกระทบที่เกิดจากความแปรปรวนของลำดับเบสบนดีเอ็นเอมนุษย์ (polymorphisms) ข้อมูลจากโครงการจีโนมมนุษย์ (human genome project) ทำให้เราทราบว่า ลำดับเบสบนดีเอ็นเอของแต่ละบุคคล มีความเหมือนกันเป็นส่วนใหญ่ คือประมาณร้อยละ 99.9 ส่วนที่แตกต่างกันออกไปประมาณร้อยละ 0.1 เป็นบริเวณที่เกิด polymorphism ของยีนหรือ single nucleotide polymorphisms (SNPs) ซึ่งมีผลต่อโครงสร้างและการทำงานของโปรตีนที่ถูกสร้างขึ้น จนทำให้เกิดพยาธิสภาพของโรคต่างๆ เนื่องจากความผิดปกติของกรดอะมิโนที่ถูกสังเคราะห์ การพยากรณ์ผลกระทบที่เกิดจาก SNPs ของมนุษย์โดย protein microarray สามารถนำมาใช้ประโยชน์เพื่อคาดคะเนความเสี่ยงในการเกิดความผิดปกติระดับโปรตีน ทำให้เราทราบถึงความผิดปกติของโรคและสามารถเฝ้าระวังหรือป้องกันการเกิดโรคเหล่านั้นได้อย่างทันท่วงที.^19,20

บทสรุป
เทคโนโลยี protein microarray จัดว่าเป็นเทคนิคใหม่ที่กำลังเข้ามามีบทบาทอย่างมากในการตรวจสอบการทำงานของโปรตีน รวมถึงการวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนชนิดต่างๆ ซึ่งรูปแบบของ protein microarray มีหลายรูปแบบขึ้นกับชนิดของโปรตีนที่ถูกตรึงบนผิวแผ่นค้ำจุนของ protein chip. ในปัจจุบัน เทคโนโลยี protein microarray ได้ถูกนำมาประยุกต์ใช้อย่างแพร่หลายในวงการแพทย์และงานวิจัยวิทยาศาสตร์ชีวภาพหลายสาขา เพื่อใช้ในการตรวจวินิจฉัยโรคและงานวิจัยทางด้าน proteomics เนื่องจากความสามารถในการตรวจสอบโปรตีนได้เป็นจำนวนมาก รวดเร็ว และใช้ปริมาณตัวอย่างจำนวนน้อย ถึงแม้ว่า protein microarray จะมีข้อดีดังได้กล่าวมาแล้ว อย่างไรก็ตาม protein microarray ยังมีข้อจำกัดในด้านของราคาต้นทุนการผลิตที่ค่อนข้างสูง ดังนั้นจึงควรพิจารณาเปรียบเทียบถึงประโยชน์ของการใช้งานและข้อจำกัดอื่นๆต่อไป.

เอกสารอ้างอิง
1. Cretich M, Damin F, Pirri G, Chiari M. Protein and peptide arrays: recent trends and new directions. Biomol Eng 2006 Jun;23(2-3):77-88.
2. Hultschig C, Kreutzberger J, Seitz H, Konthur Z, Bussow K, Lehrach H. Recent advances of protein microarrays. Curr Opin Chem Biol 2006 Feb;10(1):4-10.
3. Zhu H, Snyder M. Protein chip technology. Curr Opin Chem Biol 2003 Feb;7(1):55-63.
4. Lueking A, Horn M, Eickhoff H, Bussow K, Lehrach H, Walter G. Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal Biochem 1999 May 15;270(1):103-11.
5. Michaud GA, Salcius M, Zhou F, Bangham R, Bonin J, Guo H, et al. Analyzing antibody specificity with whole proteome microarrays. Nat Biotechnol 2003 Dec;21(12):1509-12.
6 Qiu M, Shi Y, Guo Z, Chen Z, He R, Chen R, et al. Antibody responses to individual proteins of SARS coronavirus and their neutralization activities. Microbes Infect 2005 May;7(5-6):882-9.
7. Angenendt P. Progress in protein and antibody microar-ray technology. Drug Discov Today 2005 Apr 1;10(7): 503-11.
8. Wingren C, Borrebaeck CA. High-throughput proteomics using antibody microarrays. Expert Rev Proteomics 2004 Oct;1(3):355-64.
9. Espina V, Mehta AI, Winters ME, Calvert V, Wulfkuhle J, Petricoin EF. 3^rd et al. Protein microarrays : molecular profiling technologies for clinical specimens. Proteomics 2003 Nov;3(11):2091-100.
10. Grubb RL, Calvert VS, Wulkuhle JD, Paweletz CP, Linehan WM, Phillips JL, et al. Signal pathway profiling of prostate cancer using reverse phase protein arrays. Proteomics 2003 Nov;3(11):2142-6.
11. Wulfkuhle JD, Aquino JA, Calvert VS, Fishman DA, Coukos G, Liotta LA, et al. Signal pathway profiling of ovarian cancer from human tissue specimens using reverse-phase protein microarrays. Proteomics 2003 Nov;3(11):2085-90.
12. Chan SM, Ermann J, Su L, Fathman CG, Utz PJ. Protein microarrays for multiplex analysis of signal transduction pathways. Nat Med 2004 Dec;10(12):1390-6.
13. Mircean C, Shmulevich I, Cogdell D, Choi W, Jia Y, Tabus I, et al. Robust estimation of protein expression ratios with lysate microarray technology. Bioinformatics 2005 May 1;21(9):1935-42.
14. Sheridan C. Protein chip companies turn to biomarkers. Nat Biotechnol 2005 Jan;23(1):3-4.
15. LaBaer J, Ramachandran N. Protein microarrays as tools for functional proteomics. Curr Opin Chem Biol 2005 Feb;9(1):14-9.
16. Predki PF. Functional protein microarrays : ripe for discovery. Curr Opin Chem Biol 2004 Feb;8(1):8-13.
17. Harwanegg C, Hiller R. Protein microarrays for the diagnosis of allergic diseases : state-of-the-art and future development. Clin Chem Lab Med 2005;43(12): 1321-6.
18. Master SR, Bierl C, Kricka LJ. Diagnostic challenges for multiplexed protein microarrays. Drug Discov Today 2006 Nov;11(21-22):1007-11.
19. Boutell JM, Hart DJ, Godber BL, Kozlowski RZ, Blackburn JM. Functional protein microarrays for parallel characterisation of p53 mutants. Proteomics 2004 Jul;4(7):1950-8.
20. Mills K, Mills P, Jackson M, Worthington V, Beesley C, Mann A, et al. Diagnosis of congenital disorders of glycosylation type-I using protein chip technology. Proteomics 2006 Apr;6(7):2295-304.

 
อัจฉรา ศรีสดใส ภ.บ., ปร.ด.,
อาจารย์, คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น
E-mail address:sachar@kku.ac.th